Sie besuchte die Schauspielschule in Wien und gehörte von 1914 bis 1920 als Tänzerin und Sängerin dem Ensemble des Züricher Stadttheaters an. Anfang der zwanziger Jahre kam sie nach Berlin, wo sie Kurt Weill kennenlernte und 1925 heiratete. Sie wurde bekannt als Darstellerin und Sängerin in Werken von Brecht mit Musik von Weill. So spielte sie u. a. 1928 in der Uraufführung der "Dreigroschenoper" in Berlin die Seeräuber-Jenny, 1929 in "Happy End", 1930 im "Aufstieg und Fall der Stadt Mahagonny". Zu ihren großen Theaterrollen gehörte 1929 die Ismene in "Oedipus" von Sophokles in der Inszenierung von Leopold Jessner. 1933 emigrierten Lotte Lenya und Kurt Weill nach Paris und von dort 1935 in die USA. 1955 kam Lotte Lenya u. a. zu Schallplattenaufnahmen nach Berlin. In den USA stand sie in Brecht/Weill-Stücken auf der Bühne, spielte in einigen Filmen, u. a. im James-Bond-Streifen "Liebesgrüße aus Moskau" (1964), und trat 1966 im Musical "Cabaret" in New York auf.