Er begann 1515 an der Universität Ingolstadt ein Theologiestudium. 1520 erhielt er in Eichstädt die Priesterweihe und wurde in Nürnberg Dozent für Hebräisch bei den Augustinern. Schon früh schloss er sich der neuen Lehre Martin Luthers an und war somit um 1522 der erste lutherische Prediger in Nürnberg, wo er im Februar 1522 die Pfarrstelle in der St.-Lorenzkirche angetreten hatte. Seine Predigten fanden großen Zulauf und erregten damit auch die Aufmerksamkeit der Kirchenoberen. Auf dem Nürnberger Reichstag von 1523 wurde er von katholischer Seite scharf angegriffen, und es wurde seine Verhaftung gefordert. Trotz der Hetzkampagnen und Schmähreden gegen ihn stritt er in Wort und Schrift für die neue Lehre. Osiander nahm am Religionsgespräch zwischen Luther und Zwingli 1529 in Marburg teil. Beim Reichstag von Augsburg 1530 beriet er die Nürnberger Gesandtschaft. In den folgenden Jahren befasste er sich mit der Brandenburgisch-Nürnbergischen Kirchenordnung, die 1533 publiziert wurde. Er sorgte mit J. Schoner für den Druck der Schrift von Kopernikus "De revolutionibus orbium coelestinum" (Über die Umläufe der Himmelskörper). Am 22.11.1548 verließ Osiander heimlich Nürnberg. Er folgte dem Ruf Albrechts I., d. Ä., Herzog von Preußen (1490–1568), nach Königsberg (Ostpreußen). Ab 1549 war er Professor und Prediger in der Altstadt von Königsberg. Seine Rechtfertigungslehre stand im Gegensatz zu jener von Philipp Melanchton.