Geboren im „Haus zum Roten Adler“, Unter den Linden, interessierte er sich schon als Kind für Naturwissenschaften, besonders Botanik. Nach dem Schulbesuch begann er in der väterlichen Apotheke seine Ausbildung, die er an der Apothekerschule im Thüringischen Langensalza fortsetzte und 1785 mit dem Examen abschloß. Entgegen dem Wunsch seines Vaters übernahm er nicht dessen Apotheke, sondern studierte in Berlin und Halle Botanik und Medizin. Bis dahin hatte er in und um Berlin und Halle sowie in Thüringen bereits ein Herbarium von beachtlichem Umfang gesammelt und wissenschaftlich bearbeitet. 1787 veröffentlichte er sein Erstlingswerk „Prodromus florae Berolinensis“ (Einführung in die Flora Berlins). 1789 promovierte er und ließ sich als Arzt und Apotheker in Berlin nieder. Sein Ruf als Botaniker war bis über die Grenzen des Landes gedrungen, so daß er 1790 aus Rußland eine Einladung zu einer Weltumseglung erhielt, die er aber aus familiären Gründen nicht wahrnehmen konnte. 1792 erschien sein „Grundriß der Kräuterkunde“, der in wenigen Jahren zahlreiche Auflagen in Berlin und Wien erlebte und auch in mehrere Sprachen übersetzt wurde. 1798 wurde er ordentlicher Professor für Naturgeschichte am medizinisch-chirurgischen Kollegium und bekam die Leitung des Botanischen Gartens in Schöneberg (heute Heinrich-von-Kleist-Park) übertragen, der damals zur Akademie der Wissenschaften gehörte, 1806 wurde er dessen Direktor und gleichzeitig auch Professor für Medizin. Bei Gründung der Berliner Universität 1810 wurde er dort Professor für Botanik. Willdenow war mit Alexander von Humboldt eng befreundet, und er hatte diesen schon häufig in botanischen Fragen beraten. Auf Humboldts Bitte ging er deshalb 1811 nach Paris, um die auf dessen Südamerikareise gesammelten Pflanzen wissenschaftlich zu bearbeiten. Todkrank kehrte er nach Berlin zurück, wo er bald darauf starb. – Willdenow war der bedeutendste Systematiker seiner Zeit. Er gilt als Begründer der deutschen Dendrologie, der wissenschaftlichen Gehölzkunde („Berlinische Baumzucht“, 1796), und ist gleichzeitig Begründer der Pflanzengeographie oder Geobotanik, der Lehre von der Verbreitung der verschiedenen Pflanzen auf der Erde. Er machte sich auch damit verdient, daß er die Werke des schwedischen Botanikers Carl von Linné neu herausgab. Er besaß die Häuser Friedrichstraße 84 und 85, wo er 1801 auch wohnte. Beigesetzt wurde er auf dem Friedhof der Dorotheenstädtischen Gemeinde, Bezirk Mitte.