1837 begann er in Kiel ein Studium der Philologie, 1842 erwarb er den Doktortitel und war in Kiel als Dozent tätig. Ab 1843 wandte er sich ausschließlich der Altertumskunde zu. 1846 wurde er Professor der deutschen Sprache, Literatur und Altertumskunde, 1858 ordentlicher Professor in Berlin; ab 1864 war Müllenhoff Mitglied der Preußischen Akademie der Wissenschaften. Von dem Werk "Deutsche Altertumskunde" gab er den 1. Band und einen Teil des 5. Bandes heraus. Er hat an den 1864 erschienenen "Denkmälern deutscher Poesie und Prosa aus dem 8. bis 12. Jahrhundert" und am "Deutschen Heldenbuch" mitgearbeitet sowie "Sagen, Märchen und Lieder der Herzogtümer Schleswig, Holstein und Lauenburg" gesammelt. Er ist bestattet auf dem St.-Matthäus-Kirchhof in der Großgörschenstraße.